病原微生物作为最常见的感染性疾病源头，在单细菌水平上实现病原菌的分类鉴定是感染性疾病预防和治疗的关键。共焦拉曼光谱技术是分析物质组分﹑结构等的一种有效光谱分析手段，但是基于单细菌拉曼光谱的细菌种类的快速鉴定方面的研究仍然较少。本研究以大肠杆菌为研究对象，将单细菌共焦拉曼光谱技术和机器学习中的支持向量机模型相结合，在单细菌水平上开展共焦拉曼激发波长的优化，以及5种细菌的单细菌拉曼光谱识别分类研究。研究结果为实现病原微生物的非标记、广谱快速检测奠定了基础。
分别将冷冻保存的E. coli、S. aureus、S. albus、P. aeruginosa和Salmonella菌株解冻后摇匀并注入胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，于恒温培养箱中37 ℃、120 r/min培养16 h。5种制备完成的细菌菌液分别取1 mL，用去离子水洗涤(5 000 r/min，2 min，室温) 4次，洗涤后的菌液存放于4 ℃备用。以同样方法制备存放时间为0、12、24、36、48、60和72 h的E. coli菌液。
共焦显微拉曼光谱技术无需对细菌细胞进行前处理，无需侵入细菌细胞，只需激发光束照射细菌细胞表面，通过对所得拉曼光谱进行分析，进而获取被测细菌物质的成分特征，最终实现细菌种类的鉴定。单细菌共焦拉曼光谱的具体测定流程如图1所示。
图 1 单细菌共焦拉曼光谱测定流程图
取1 µL洗涤后的E. coli菌液滴加在铝基板上，干燥15 min后，将样品放到共焦拉曼光谱仪中，依次选择激发光源波长为532、633和785 nm的激光进行试验并采集光谱。对3种激发波长下的单个E. coli拉曼光谱进行统计分析。为实现细菌种类的自动鉴别，本研究建立了基于SVM模型的机器学习算法。SVM建模过程如图2所示。
图 2 SVM建模过程示意图
在基于SVM的单细菌拉曼光谱数据分类模型应用前，采用最小二乘法和权重法对原始数据进行数据预处理，去除极端高强度光谱，得到5种细菌拉曼光谱数据集。数据预处理前后拉曼光谱对比如图3所示。
图 3 数据预处理前后拉曼光谱对比
A：采集的原始拉曼光谱数据；B：最小二乘法处理后的拉曼光谱；C：权重法一次平滑后的拉曼光谱；D：权重法二次平滑后拉曼光谱
利用采集的拉曼光谱数据库对5种细菌应用SVM模型进行识别分类，并探究E. coli的存放时间对其单细菌拉曼光谱信息的影响。
在光谱采集参数激光强度为6 mW、积分时间为10 s、物镜倍数为100×时，3种激发波长的测试结果如图 4所示。由图 4D可以看出，激发波长为532 nm和633 nm时E. coli的重复性均较好，特征峰峰值及信号幅值稳定，一致性较高。因此，选取6个关键特征峰计算2种激发波长下的信噪比，激发波长为532 nm时SNR整体效果较优。
图 4 不同激发波长激光下Escherichia coli拉曼重复性测试
A：激发波长为532 nm的激光下E. coli拉曼重复性测试；B：激发波长为633 nm的激光下E. coli拉曼重复性测试；C：激发波长为785 nm的激光下E. coli拉曼重复性测试；D：3种激发波长下E. coli拉曼光谱对比
选择激发波长为532 nm，激光强度为6 mW，积分时间为10 s，进行5种细菌的单细菌共焦拉曼光谱探测，结果如图 5所示。在5种细菌的单细菌拉曼光谱中，855、1 126、1 231、1 448、1 579和1 662 cm−1峰是5种细菌共有的特征峰。经过5种细菌的拉曼特征峰归属分析，可以看出5种细菌的拉曼光谱之间存在较明显差异。
图 5 5种细菌的单细菌拉曼光谱
本研究首先以E. coli为研究对象，进行了532、633和785 nm这3种激发波长下的拉曼光谱对比分析实验。实验结果表明，在532 nm激发波长下，E. coli拉曼光谱的重复性良好，其特征峰峰位和信号幅值稳定。其次，对S. albus、E. coli、S. aureus、Salmonella、P. aeruginosa等5种细菌进行了无增减的拉曼光谱采集，建立了SVM模型后对5种细菌进行鉴别，验证了基于单细菌共焦拉曼技术进行细菌快速鉴定的可行性。最后，对不同保存时间的E. coli拉曼光谱进行重复性测试和对比。结果表明，E. coli的拉曼特征峰无偏移，表明不同存放时间对E. coli的拉曼光谱信息几乎无干扰。
综上所述，基于单细菌共焦拉曼光谱探测技术可以实现非标记、无增强的单细菌拉曼散射光谱探测，未来可应用于样本浓度低、样本量少的细菌快速检测中，实现在环境、人体等少量采样条件下即可检测细菌种类。结合SVM模型可以实现细菌种类的快速鉴别，未来可通过对多种细菌建立丰富的拉曼光谱库，并进行持续拉曼光谱采集和自主学习，从而实现在复杂环境下、混合采样后多未知采样细菌种类的快速鉴别。
普识纳米PERS-RG1525全自动显微拉曼光谱仪能够很好地应用与单细菌样品的检测与分析中。仪器灵敏度高，信噪比高，最小光斑可达1μm，性能可媲美大型实验室拉曼光谱设备，能够在单细胞水平上进行拉曼光谱检测，实现微生物的快速鉴定和分类。
集成了自动对焦、mapping成像功能，仪器在微塑料、单细菌样品检测中拥有极佳的检测能力。配合普识纳米自主研发的多种规格增强试剂，可满足不同结构物质分析，在生物、材料、化学、医药、考古等行业具有良好的应用。
